Филогенетический анализ изолятов вируса болезни Ньюкасла

Вирус болезни Ньюкасла (БН) широко распространенное заболевание, регистрируемое во многих странах и поражающее многие виды диких и домашних птиц.

Несмотря на значительные успехи в диагностике, эпизоотологии, изучении патогенности вируса БН на молекулярном уровне, проблема борьбы с этим особо опасным заболеванием птиц остается актуальной [1, 2]. В основе профилактики болезни Ньюкасла лежат неспецифические и специфические средства защиты и методы их осуществления [3, 4].

Возбудитель БН – РНК-содержащий вирус (парамиксовирус птиц типа 1) являющийся таксоном рода Avulavirus, подсемейства Paramyxovirinae, семейства Paramyxoviridae, порядка Mononegavirales и характеризующийся минус-нитевым РНК-геномом. Его вирионная РНК представлена шестью генами, кодирующими гемагглютинин-нейраминидазу (HN), нуклеопротеин (NP), фосфопротеин (P), матриксный белок (М), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L) и белок слияния (F), и двумя неструктурными белками V и W [5].

Для идентификации изолятов вируса болезни Ньюкасла были использованы полимеразная цепная реакция в реальном времени (РВПЦР) и антигенный анализ с помощью моноклональных антител. Реагенты для реакции были предоставлены Шведским ветеринарным университетом (SVA) города Упсала.

Для выделения вируса использовали клоакальные смывы и кусочки органов от домашних и диких птиц. До начала исследований пробы хранили в низкотемпературном морозильнике (±70 ºС).
РНК вируса БН выделяли с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) согласно инструкции. Реакционный объем составил 20 мкл, а концентрация праймеров 10 мкмоль на реакцию. Постановка реакции была проведена согласно протоколу к диагностическому набору. Был проведен 1 цикл в режиме 50 °С – 15 мин, 95 °С – 5 мин и 45 циклов амплификации в режиме 90 °С – 30 сек, 60 °С – 60 сек. РВПЦР проводили в приборе Rotor Gene 6 000 (Software). Результаты проведенной РВ-ПЦР приведены в таблице.

Таблица. Результаты исследованных образцов БН в РВ-ПЦР

Область Вид птиц Количество исследованны х птиц Трахеальный смыв   Клоакальный смыв
количество образцов результат количество образцов результат
Джамоат Мирзо Ризо, г. Гиссар утка 2 2 отрицательный 2 отрицательны й
цыпленок 2 2 положительный 2 отрицательны й
голубь 2 2 отрицательный 2 отрицательны й
куропатка 1 1 положительный 1 отрицательны й
индюк 1 1 положительный 1 отрицательны й
Джамоат Чимтепп а дикий голубь 3 3 положительный 3 отрицательны й

Как видно из таблицы, из 22 исследованных проб в 2-х выявлены РНК вируса болезни Ньюкасла. При этом положительный результат отмечен только у кур. Все пробы уток, голубей, куропаток, индюков из Гиссарского района и диких голубей из джамоата Чимтеппа района Рудаки дали отрицательный результат в РВ-ПЦР. Результаты ПЦР в реальном времени приведены на рис. 1.

Рис.1. Результаты РВ-ПЦР на вирус БН Премечание: ПК – положительный контроль; ОК - отрицательный контроль; Образец-2 – трахеальный смыв цепленка 1.1; Образец-3 – трахеальный смыв цепленка 2.1.

Рис.1. Результаты РВ-ПЦР на вирус БН
Премечание: ПК – положительный контроль; ОК — отрицательный контроль; Образец-2 – трахеальный смыв цепленка 1.1; Образец-3 – трахеальный смыв цепленка 2.1.

Совместно со специалистами Шведского национального ветеринарного университета (SVA, Упсала) изучено филогенетическое дерево изолята вируса болезни Ньюкасла, выделенного в Таджикистане.
При скрининге материалов Гиссарского района в ПЦР получены положительные результаты с обнаружением специфических продуктов 300 пар оснований, что свидетельствует о наличии РНК вируса БН в исследованных образцах.

После выделения вируса проведено секвенирование фрагмента гена, кодирующего белок слияния (F-протеин). В результате секвенирования расшифрована последовательность нуклеотидов, которая включает сайт расщепления белка слияния, что важно для выявления его патогенности.

Для определения филогенетических взаимоотношений секвенированного вируса осуществлен анализ имеющихся в международной базе данных полных нуклеотидных последовательностей F-гена (GGRRQKRFIGAV) ПМВ-1.

Результаты молекулярно-биологического исследования в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и методом нуклеинового секвенирования генома позволили идентифицировать изолят от домашних птиц, относящийся к авулавирусу птиц 1- серотипа,7i — генотипа (VIIi), т.е. вирус БН (Avian Avulavirus type 1) (рис. 2).

Рис. 2. Дендрограмма Гиссарского изолята вируса болезни Ньюкасла по антигенному родству выполненная в Шведском национальном ветеринарном университете (SVA), Упсала.

Рис. 2. Дендрограмма Гиссарского изолята вируса болезни Ньюкасла по антигенному родству выполненная в Шведском национальном ветеринарном университете (SVA), Упсала.

Как видно из рис. 2, Гиссарский изолят вируса болезни Ньюкасла (на рисунке текст выделен) по антигенному варианту совпадает на 98 % с штаммами стран южной Азии, такими как Шри Ланка и Пакистан.

Заключение
Таким образом, с помощью ОТ-ПЦР и моноклинальных антител показана степень антигенного родства вируса болезни Ньюкасла, циркулирующего в Таджикистане, с вирусами из других стран.

Авторы


Д. М. Шоназар, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабраторией диагностики вирусных болезней животных и птиц Института проблем биологической безопасности ТАСХН (ИПББ), Душанбе
Г. Н. Мамадатохонова, старший научный сотрудник Института проблем биологической безопасности ТАСХН (ИПББ), Душанбе
С. Зохари, микробиолог, Шведский национальный ветеринарный университет (SVA), Упсала


Библиографические ссылки
1. Безбородова Н. А., Ким Н. А.Сравнение лабораторных методов диагностики инфекций, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами // Эффективное животноводство. 2018. № 2 (141). С. 46–47.
2. Методы клинико-лабораторной диагностики острых респираторных вирусных инфекций у крупного рогатого скота / Порываева А. П., Печура Е. В., Вялых И. В., Томских О. Г., Бусыгина Н. С. // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2017. № 3. С. 55–58.
3. Alexander D. J. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses Rev Sci Tech, 2000. № 19 (2). Р. 443–462.
4. Kaverin N. V., L’vov D. K. Paramiksovirusy (Paramyxoviridae) [Paramyxoviruses]. V kn.: Medicinskaja virusologija, 2008. Р. 183–189.


Уралбиовет
Опубликовал Уралбиовет Апрель 2, 2019 15:09