Сальмонеллез как распространенный пищевой зооноз является актуальной медико-экологической проблемой. Применение пробиотического биокомплекса, содержащего молочнокислые бактерии (МКБ), снижает риск заражения цыплят сальмонеллезом.
Введение
Желудочно-кишечный тракт является определенным пулом микроорганизмов с огромным количеством и большим разнообразием видов бактерий, адаптированых к хозяину – макроорганизму. В зобе птицы или желудке с верхним отделом тонкого кишечника содержится 10³ КОЕ/мл содержимого, в нижнем отделе тонкого кишечника – 105–106 КОЕ/мл, в толстом кишечнике и слепых отростках – до 1012 КОЕ/мл [2]. В норме такая разнообразная микробная популяция представляет собой относительный симбиоз и находится в динамическом равновесии, когда патогенные виды не являются преобладающими. Полезная и условно-патогенная микрофлора как две группы по отношению к хозяину действуют различно при определенных физиологических изменениях макроорганизма.
При нарушениях общей резистентности организма условно-патогенные микроорганизмы могут вызвать заболевания, в том числе сальмонеллез. Клинически здоровая птица зачастую является носителем возбудителей сальмонелл. В нашей стране сложилась неблагополучная ситуация по этому заболеванию. Сальмонеллез признан актуальной ветеринарной, медицинской, экологической, социальной проблемой.
В птицеводстве Российской Федерации существует национальная программа контроля и профилактики сальмонеллезов. По данным ВГНКИ, основанным на сведениях Референс-центра по сальмонеллезам и глобального десятилетнего мониторинга ВОЗ за пищевыми инфекциями, 47 % вспышек инфекций в мире – сальмонеллезы, и существенная роль фактора передачи инфекции человеку через пищевые продукты принадлежит куриному мясу (34 %) [3].
В Российской Федерации к инкриминированным во вспышках сальмонеллеза человека пищевым продуктам относятся: мясо животных и мясопродукты – 63 %, куриное мясо 28 %, яйцо – 5,5 %. Из общего числа выделенных от животных штаммов сальмонелл в 49,6 % случаев они обнаруживаются у птиц. При этом, в рамках всего двух видов возбудителей Salmonella enteritidis (45,8 %) и Salmonella gallinarum– pullorum (24,9 %), выделенных от человека или от контаминированных пищевых продуктов, объектов внешней среды, выявлено больше всего серотипов («сероваров»). В птицеводческих помещениях существуют предпосылки для рециркуляции возбудителя заболевания. Такие мероприятия, как вакцинация и дезинфекция недостаточны для предотвращения распространения сальмонеллеза.
С целью повышения общей резистентности организма самых восприимчивых к заражению животных и птиц рекомендовано применять пробиотики как экологически чистую альтернативу антибиотикам, как средство быстрого восстановления нормального микробиома, являющегося важным условием правильного обмена веществ и формирования на этом фоне неспецифической резистентности организма. [5, 8, 9]. Целью настоящих исследований явилось изучение микробиома ЖКТ зараженных S. enteritidis цыплят-бройлеров, которым выпаивали с суточного возраста пробиотический биокомплекс, содержащий МКБ.
Материал и методы исследований
Методика экспериментального инфицирования цыплят-бройлеров возбудителем сальмонеллеза разработана во ВНИВИП. Для определения вирулентных свойств патогенного тест-штамма провели интраорбитальное заражение суточной бульонной культурой цыплят, гибель которых наступила в течение 2–5 дней в результате генерализованного процесса (катаральная пневмония) [1].
В эксперименте были задействованы бройлеры кросса РОСС 38 (n=55), содержащиеся в клеточных батареях вивария в течение 38 дней выращивания. Условия кормления и содержания птиц соответствовали существующим рекомендациям ВНИТИП. Опытные группы получали путем распыла на корм непосредственно перед кормлением пробиотический биокомплекс, содержащий молочнокислые бактерии. Контрольным группам никакие препараты не назначали. В возрасте 21 день птиц опытной группы заражали однократно внутримышечным путем.
Для получения данных по микробиому ЖКТ еженедельно исследовали сборные групповые пробы свежего помета по методике ВНИВИП. Выборочный убой цыплят производили со 2-й недели выращивания с целью проведения бактериологического исследования проб патматериала, определения рН содержимого каждого отдела ЖКТ и взятия образцов для гистологического исследования.
После заражения цыплят S. enteritidis посевы сборных проб помета предварительно подращивали в жидкой низкопитательной, затем в элективной среде (при посеве непосредственно на плотную среду сальмонеллы не выделяются). Наиболее эффективной для роста S. enteritidis явилась питательная среда с тиогликолем. Выделенные из проб помета лактобактерии количественно определяли методом серийных разведений навески содержимого с последующим высевом на элективные питательные среды (лактобакагар и пр.). Идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с критериями, изложенными в определителе бактерий Берджи [7].
Результаты исследований
За период выращивания цыплят-бройлеров падеж отсутствовал, птицы оставались клинически здоровыми. В течение 3–10 дней после экспериментального инфицирования у зараженных цыплят наблюдались некоторые изменения: угнетенное малоактивное состояние, признаки затрудненного дыхания, а также кратковременное внешнее изменение помета (консистенции и цвета). Однако интерес к корму и аппетит у таких птиц оставались на уровне цыплят, не подвергнутых заражению возбудителем S. enteritidis.
При вскрытии и патолого-морфологическом исследовании вынужденно убитых на 4–5-й неделе цыплят в четырех случаях обнаружили катаральный энтерит: отечность, точечные кровоизлияния, увеличение кровеносных сосудов, наличие спаек на тонком кишечнике. Гистологическое исследование взятых образцов тонкого и толстого кишечника показало наличие десквамации эпителия, признаки гиперемии и отека слизистой оболочки. Кроме единичной встречаемости признаков нарушения целостности слизистой оболочки ЖКТ, иные патологоанатомические изменения у контрольных и опытных цыплят в конце периода выращивания отсутствовали.
Результаты исследования рН содержимого каждого отдела ЖКТ – железистого желудка, мышечного желудка, тонкого и толстого кишечника цыплят разного возраста опытной группы представлены в таблице 1. Выявлено несоответствие существующим нормативным показателям рН [4, 6]. Оптимальное значение рН для развития полезной микрофлоры установлено только у птиц на 4-й неделе. В целом, наблюдалась тенденция к смещению рН в щелочную сторону в железистом желудке и кислую – в тонком кишечнике.
С первых недель в групповых пробах свежего помета наблюдался рост колоний лактобактерий, которые идентифицировали следующим образом: 1) Поверхностные точкообразные размером до 1 мм, с гладкими контурами, белесые, полупрозрачные колонии; штрих узкий, нитевидный; глубинные колонии мельче, чем поверхностные, относятся к S-форме – определили как кокковые МКБ с моно- и диплококко выми клетками – в первом случае Streptococcus cremoris, во втором – Streptococcus lactis;
Таблица 1. Значение рН в отделах ЖКТ цыплят разного возраста
| Опытная группа цыплят, возраст / рН | Уровень рН в разных отделах ЖКТ, рН | |||
| Желудок | кишечник | |||
| железистый | мышечный | тонкий | толстый | |
| 2-я неделя | 3,8 | 2 | 4,2 | 3,5 |
| 3-я неделя | 2,5 | 2 | 5,8 | 5 |
| 4-я неделя | 5 | 2,5 | 6 | 7 |
| Нормативный показатель рН | 2 | 5 | 6 | 7,5 |
2) Глубинные R-формы колонии более крупные, 1,5–2 мм в диаметре, белого цвета; штрих длинный, извитый; при микроскопии зернистость не прокрашена, имеются волокнистые выросты – определили как молочнокислые палочки Lactobacillus acidophilum (более строгий факультативный анаэроб).
Результат количественного определения содержания лактобактерий, представленный в таблице 2, отражает колонизационную активность полезной микрофлоры.
Таблица 2. Количественное содержание лактобактерий в групповых пробах свежего помета цыплят-бройлеров опытной и контрольной групп
| Группа | Возраст | Количество, КОЕ/гр, в среднем |
| Опытная | 2-я неделя | 4,2 х 10 6 |
| 3-я неделя | 4,4 х 10 7 | |
| Контрольная | 2-я неделя | 3,4 х 10 6 |
| 3-я неделя | 2,4 х 10 7 |
За период наблюдений отобрано 80 групповых проб свежего помета. В результате бактериологических исследований установили частоту выделения условно-патогенных микроорганизмов: E. coli – 40 %, Proteus spp. – 15 %, St. aureus – 12 %. S. enteritidis выделена в 2,8 % проб от инфицированных цыплят. Культуры Сitrobacter, Рseudomonas, Enterococcus и Streptococcus выделялись в единичных случаях. В пробах помета контрольной группы цыплят 4-й недели выращивания выделена E.coli в количестве 4,28 КОЕ/г, St.aureus – 1,97 КОЕ/г, Proteus spp. – 1,67 КОЕ/г. В опытной группе цыплят 4-й недели выращивания: E.coli – 1,6 КОЕ/г, St.aureus – 1 КОЕ/г, протей не выделен. В целом, у цыплят 2-й и 3-й недель выращивания количество выделенных колоний отличалось на 0,6–0,9 %, и между 2-й и 5-й неделями выращивания разница составила 1,2–2,4 %. Таким образом, с возрастом цыплят численность групп кишечных микроорганизмов закономерно увеличивалась.
Посевы крови из сердца, печени на дифференциально-диагностические среды в случае положительного роста сальмонелл давали рост колоний темно-красного цвета с металлическим блеском. Результаты бактериального исследования посевов патматериала инфицированных S. enteritidis цыплят представлены в таблице 3. У группы, получающей с суточного возраста пробиотический биокомплекс, ни одного случая выделения сальмонелл зарегистрировано не было. Установлено снижение частоты выделения в патматериале S. enteritidis, E. coli, St. aureus, Proteus spp., что демонстрирует эффективность выпаивания пробиотического биокомплекса.
Таблица 3. Частота выделения из патматериала условно-патогенной микрофлоры через 7 дней после экспериментального инфицирования
| Вид микроорганизма | Орган выделения | Контроль, % | Опыт, % |
| E. coli | Сердце | 80 | 10 |
| Печень | 80 | 33 | |
| St. aureus | Сердце | 20 | 0 |
| Proteus spp. | Печень | 40 | 0 |
| S.enteritidis | Сердце | 4,5 | 0 |
Заключение
Бактериологические исследования экспериментально зараженных сальмонеллой цыплят подтвердили, что среди условно-патогенной микрофлоры доминирует E.coli. На выделение других микроорганизмов влияет возраст цыплят, субстрат выделения, колонизационная активность полезных бактерий. Определить бактериальную обсемененность органов и тканей цыплят можно по частоте выделения условно-патогенной микрофлоры.
Полученные данные микробиома цыплят свидетельствуют об эффективности пробиотического биокомплекса: при бактериальном исследовании внутренних органов не было ни одного случая выделения сальмонелл, выделение S. enteritidis из групповых проб помета экспериментально инфицированных птиц подтверждает факт носительства, цыплята оставались клинически здоровыми весь период выращивания.
Выделенную молочнокислую культуру L. acidophilum необходимо изучить в отношении антагонистической активности относительно патогенных возбудителей бактериальных болезней птиц с целью ее дальнейшего культивирования и включения в производство пробиотического биокомплекса.
Автор
Ж. А. Проккоева, младший научный сотрудник отдела микробиологии «Всероссийского научноисследовательского ветеринарного института птицеводства» — филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения Федерального научного центра «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» Российской Академии наук (ВНИВИП), Санкт-Петербург
Библиографические ссылки
1. Борисенкова А. Н., Новикова О. Б. Спектр микрофлоры, выделяемой от птиц в хозяйствах различного технологического направления // РацВет-Информ. 2003. № 10. С. 3–6.
2. Зинченко Е. В., Панин А. Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино : ОНТИ ПНУ РАН, 2000. 164 с.
3. Куликовский А. Сальмонеллез: мониторинг необходим. URL: http://www.zzr.ru/sites/ default/fi les/zzrs-2016-01-025.pdf (дата обращения: 10.11.2018).
4. Лебедева И. А. Новикова М. В. Влияние пробиотического препарата Моноспорин на состояние железистой части желудка цыплят-бройлеров //Аграрный вестник Урала. 2009. № 12 (66). С. 63–65.
5. Лебедева И. А., Проккоева Ж. А. Эффективность применения в птицеводстве биокомплексов на основе пробиотических штаммов // Сборник статей межд. науч.-практ. конф. «Биотехнология и общество в XXI веке», Барнаул. АлтГУ, 2015. 436 с.
6. Нормы содержания микрофлоры в желудочно-кишечном тракте цыплят-бройлеров / Методические рекомендации. СПб. : Биотроф, 2014. 23 с.
7. Определитель бактерий Берджи // Под ред. Дж. Хоулта, Заварзина Г. А. / 9-изд. : в 2 т. М. : Мир, 1997. 800 с.
8. Опыт применения пробиотического препарата «Моноспорин» в схемах лечения коров с хроническим эндометритом / И. В. Степанов, О. И. Заузолкова, У. В. Сивкова, М. В. Ряпосова // Ветеринария Кубани. 2013. № 2. С. 8–9.
9. Ряпосова М. В. Применение пробиотического препарата «Моноспорин» в комплексных схемах лечения коров с хроническим эндометритом // В сборнике: Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России. 2012. С. 209–212.
