Основное назначение вакцин – создание активного поствакцинального иммунитета, который по своему характеру и конечному эффекту соответствует постинфекционному иммунитету, иногда отличаясь от него лишь по уровню напряженности (интенсивности).
Вакцинальный процесс при введении живых вакцин напоминает инфекционный, но отличается доброкачественностью течения. Также при введении живых вакцин происходят размножение и генерализация аттенуированного (ослабленного) штамма в организме вакцинированного животного или птицы и вовлечение в процесс иммунной системы. Иммунная реакция на вакцинные штаммы вируса или их антигены может носить выраженный гуморальный, клеточный или клеточно-гуморальный характер.
В зависимости от биологической модели, на которой накапливали вирус, вакцины подразделяют на 5 групп.
Тканевые вакцины.
Из мозговой ткани овец, зараженных пастеровским штаммом «фикс» вируса бешенства, готовят вакцину против бешенства для ветеринарных целей. Свободные от миелина антирабические вакцины производят из тканей головного мозга новорожденных мышей.
Лапинизированные вакцины.
Препараты из тканей крольчат, зараженных, например, адаптированным к ним вакцинным штаммом вируса ящура или классической чумы свиней.
Авианизированные вакцины. Препараты, при производстве которых используют эмбрионы птиц или живых цыплят.
Культуральные вакцины.
Это вакцины против ящура, бешенства, болезни Ауески, классической чумы свиней, ньюкаслской болезни, ИЛТ и других. Готовят их с накоплением вакцинного штамма на культурах клеток.
Дивергентные вакцины.
Они же – вакцины из гетерологичных вирусов, образованные при помощи «подхода Дженера». Данный подход заключается в использовании в качестве вакцинного штамма вирусов, как правило, не патогенных, а значит, не нуждающихся в аттенуации, выделенных от животных или птиц другого вида.
Так, вирус герпеса индеек защищает кур от болезни Марека; вирус кори человека в состоянии защитить щенков от чумы плотоядных; вирус оспы голубей создает иммунитет против оспы кур; вакцина против натуральной оспы человека создана на основе непатогенного для человека вируса оспы коров; вирус фиброматоза предохраняет кроликов от миксоматоза (вакцина из гетерологичных штаммов вирусов).
В зависимости от типов возбудителей и их количества различают вакцины 21 вида.
1. Моновалентные вакцины. Содержат антиген микроорганизма одного вида.
2. Поливалентные (би-, трехвалентные и более) вакцины. Изготавливаются из нескольких типов микроорганизмов одного вида. Например, трехвалентную противоящурную формолвакцину получают из культурального вируса ящура серотипов О-А-С.
3. Ассоциированные вакцины. Содержат антигены возбудителей разных видов или антигены возбудителя одного и того же вида, но в различных вариантах (скажем, корпускулярный и молекулярный антигены).
Пример – вакцина «Бивак» против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота.
4. Смешанные вакцины. Являются разновидностью ассоциированных вакцин и представляют собой смесь вирусных и микробных антигенов.
Пример – вакцина против чумы плотоядных, ботулизма и вирусного энтерита.
5. Комбинированные вакцины.
Представляют собой препараты, состоящие из вирусного (или микробного) антигенного компонента и синтетических веществ (полиакриловой кислоты и др.) – стимуляторов иммунного ответа.
6. Живые вакцины.
Производятся из аттенуированных (искусственно ослабленных), селекционированных или слабовирулентных естественных (природно-ослабленных) штаммов вирусов.
Живые аттенуированные вакцины. Чаще всего они изготавливаются из гомологичных аттенуированных штаммов (т. е. из утративших вирулентность патогенных штаммов, сохранивших иммуногенную активность) путем многочисленных пассажей вирусов на биологических системах (эмбрионах птиц или культурах клеток, на животных или птицах) и/или путем воздействия на вирусы в процессе их культивирования в лабораторных условиях под воздействием физических или химических факторов.
Л. Пастер аттенуировал вирусы серийными пассажами на нетрадиционном хозяине. В частности, посредством интрацеребральных пассажей уличного вируса бешенства на кроликах он получил вакцинный штамм, известный под названием вирус «фикс». Пассированием на кроликах были созданы вакцинные штаммы вирусов чумы КРС и классической чумы свиней. Путем серийных пассажей на мышах получены вакцинные штаммы вируса гриппа и ящура; путем пассажей на эмбрионах кур – вакцинные штаммы вируса болезни Ауески, чумы плотоядных и гепатита утят.
На культуре клеток по близкому принципу созданы вакцинные штаммы чумы КРС, ИРТ, вирусной диареи КРС и ящура.
Природно-ослабленные вирусы – это вирусы, циркулирующие в различных популяциях животных, не вызывая у них патологии. При этом данные вирусы способны индуцировать выработку высокого уровня иммунитета. После «доработки» в лабораторных условиях эти вирусы используются как вакцинные.
Гибриды, полученные из «актуальных» эпизоотических штаммов вирусов и безвредных для животных и птиц штаммов, характеризуются авирулентностью.
Живые неаттенуированные вакцины. Такие вакцины могут содержать и «дикий» (полевой) вирус, но применяют их нехарактерным для внедрения вируса путем. В результате репликация вируса в месте его введения ограничивается, и развивается бессимптомная инфекция, заканчивающаяся выработкой иммунитета. В США, например, для профилактики у солдат аденовирусной инфекции используют вирус «дикого» типа, заключенный в таблетки с покрытием. Когда такая таблетка достигает кишечника, вирус освобождается, но желудочно-кишечный тракт не является его естественной средой обитания, и аденовирус данного типа заболевания не вызывает. Макрофаги и специализированные антигенпрезентующие клетки передают информацию о попавшем в кишечник возбудителе аденовирусной инфекции Т- и В-лимфоцитам, в результате чего обеспечиваются иммунный ответ и последующая устойчивость к инфекции.
Любой вакцинный штамм должен быть хорошо изучен, классифицирован, клонирован и паспортизирован. Плюс он не должен вызывать специфического инфекционного процесса или существенных осложнений после введения 5–10-кратных иммунизирующих доз.
Для штаммов вирусов, подготовленных в качестве вакцинных, обязательны:
- иммуногенность;
- низкая реактогенность (аллергенность);
- отсутствие риверсибельности, тератогенных, эмбриотропных и онкогенных свойств;
- генетическая стабильность;
- длительный срок хранения;
- технологичность производства;
- простота и доступность в применении.
Перед выпуском с биофабрики живые вакцины проверяют как минимум:
- на реактогенность;
- иммуногенную активность;
- биологическую активность;
- бактериальную обсемененность.
Выпускаются живые вакцины в лиофилизированной форме (в ампулах, флаконах, в виде таблеток).
Живые вакцины применяются:
- методом выпаивания;
- перорально (с кормом в виде болюсов);
- аэрозольно (в виде мелкодисперсной или крупнодисперсной аэрозоли – спрей-метода);
- методом введения [интраназально, внутримышечно, подкожно, внутриклоачно (ИЛТ), в эмбрион, на заключительной стадии инкубации (болезнь Марека, болезнь Гамборо, или ИББ)];
- методом нанесения на скарифицированную кожу (оспа).
7. Инактивированные цельновирионные (корпускулярные) вакцины. Содержат полный набор антигенов. Готовят их из накопленного на биологической модели производственного вирулентного штамма вируса, инактивированного с помощью химических или физических факторов. Инактивация чаще всего проводится химическим способом: формалином (формальдегидом в конечной концентрации 0,05–0,2 %), теотропином (А-24), димерэтиленимином, мертиолатом натрия, карболовой кислотой и др.). К физическим способам относят радиоактивное излучение, ультрафиолет, температуру.
К инактивированному вирусу (антигену) добавляют адъювант, обычно в дозе 1:1, и после проверки по ряду параметров вакцина готова к применению. Адъюванты – это соединения, которые при введении в организм активируют пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, повышают способность организма реагировать на любой иммуноген. В результате адсорбции на адъюванте происходит укрупнение антигена, и он лучше захватывается и активнее представляется фагоцитирующими клетками. В месте введения адъюванты вызывают депонирование антигена, затем медленное и длительное его высвобождение в организм. Адъювантными свойствами обладают масла, прямые и обратные масляные эмульсии, полиэлектролиты, гидроокись алюминия, липосомы, клетки бактерий, полимеры и наномолекулярные эмульсии.
Наномолекулярные эмульсии (наноструктурные адъюванты, микроэмульсии) выполняют функции адресной доставки компонентов вакцины к клеткам иммунной системы и иммуностимуляции различных механизмов иммунного ответа. Состоят наноэмульсии из двух жидких фаз – или масляных капель в воде, или водных капель в масле. Размер капель, как правило, колеблется от 50 до 600 нм.
Наноэмульсионные вакцины вызывают мощный местный иммунитет при инфекциях, вызванных возбудителем, проникающим через слизистые, а также иммунитет клеточный. Большое преимущество таких вакцин состоит в том, что они могут применяться интраназально. По некоторым параметрам нановакцины более эффективны, чем вакцины с традиционными адъювантами. Наноразмерность придает веществу особые химические, физические, физико-химические и биологоческие свойства, которые могут значительно отличаться от свойств этого же вещества в исходной форме.
Одним из интересных направлений использования наноэмульсий является разработка на их основе усовершенствованных вакцинных препаратов. Во ВНИВИП – филиале ФНЦ ВНИТИП РАН старшими научными сотрудниками А. С. Дубовым и Г. Н. Самусевой разработаны и успешно апробированы в лабораторных условиях наноэмульсионные вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного бронхита кур.
Образцы вакцин № 1 (инактивированная эмульгированная вакцина против ИБК) и № 2 (наноэмульсионная вакцина против ИБК) после успешной проверки на стерильность, стабильность эмульсии, вязкость, полноту инактивации и безвредность протестировали на цыплятах на антигенную-иммуногенную активность с оценкой результатов по титрам поствакцинальных антител в ИФА. Установлено, что вакцина № 2 индуцирует более высокий уровень иммунного ответа, чем стандартная вакцина № 1. В настоящее время проводятся комплексные исследования по дальнейшему изучению и усовершенствованию препарата.
Комплексный масляный адъювант содержит в качестве основы высокоочищенное минеральное масло (Маркол 52 или Дракеол 6ВР, Байоль Ф и др.) в комбинации с эмульгатором и поверхностно-активным веществом (Монтанид 103 или Арлацел А).
Полный адъювант Фрейнда, в состав которого входят смесь минеральных масел, эмульгатор и убитые микобактерии, введенный животному, вызывает образование болезненных гранулем. В настоящее время из-за своей высокой реактогенности (т. е. развития сильных поствакцинальных осложнений) адъювант Фрейнда при производстве вакцин не применяется.
Инактивированные вакцины перед выпуском с биофабрики проверяют:
- на полноту инактивации;
- иммуногенную активность;
- реактогенность (т. е. на угрозу вызывать поствакцинальные осложнения);
- бактериальную обсемененность.
Инактивированные вакцины бывают и жидкими, и сухими (сухая вакцина против бешенства – медицинская). Вводят их внутримышечно или подкожно.
8. Химические вакцины. Данные вакцины не содержат в своем составе генома вируса, поэтому они безопасны. Термин «химическая вакцина» не вполне корректен, поскольку такие вакцины не являются химическими веществами в чистом виде, а представляют собой группы антигенов, эндотоксинов и т. д. Ранее к химическим вакцинам относили субъединичные вакцины и сплит-вакцины, но только потому, что их наработка проводилась с использованием многих физико-химических методов и реактивов.
9. Субъединичные (компонентные) вакцины. Содержат в своем составе отдельные антигенные компоненты вирусов, в том числе наборы протективных вирионных белков (антигенов) или отдельный поверхностный протективный белок, выделенные из разрушенных вирионов или их клеточных мембран. Такие компоненты необходимы для выработки защитного иммунного ответа. Выделение данных иммуногенных компонентов происходит с использованием физико-химических методов.
Данные вакцины, подобно вакцинам инактивированным, не содержат живых компонентов патогена. Реактогенность у субъединичных вакцин меньше, чем у цельновирионных. Они безопасны, но слабо активизируют некоторые звенья клеточно-опосредованного иммунного ответа и не гарантируют формирования хорошей иммунологической памяти на данные антигены. Иммуногенность повышают посредством применения адъювантов (сорбирования на гидроксиде алюминия).
10. Сплит-вакцины (расщепленные вакцины). Во многих субъединичных вакцинах отсутствуют внутренние антигены вируса, поэтому иммуногенная эффективность у субъединичных вакцин несколько ниже, чем у сплит-вакцин (на 10–15 %). Теоретически сплит-вакцины имеют некоторый «запас» профилактической эффективности по сравнению с субъединичными вакцинами.
Готовят сплит-вакцины из продуктов химического расщепления вирионов, включая в состав все антигены, освобожденные от генома и липидов, поэтому пирогенность сплит-вакцин снижается. Благодаря высокой очистке в сплит-вакцине меньше токсичных субстанций, отсутствуют вирусные липиды и белки куриного эмбриона. Небольшие размеры вводимых антигенных комплексов обуславливают быстрое выведение их из организма и краткое антигенное раздражение иммунной системы. Поэтому в состав сплит-вакцин включают адъюванты, в качестве которых используются минеральные адсорбенты (гидрат окиси алюминия, фосфат кальция) и минеральные масла.
В качестве вакцин используются сами модифицированные микроорганизмы или протективный антиген, образующийся при их культивировании в условиях in vitro. В первом случае иммунный ответ направлен не только против продуктов встроенного гена, но и на носитель вектора.
11. Генно-инженерные (рекомбинантные) вакцины. Их изготавливают с помощью генетической рекомбинации. Целевой ген, полученный методом химического синтеза или путем выделения (клонирования), с помощью ферментов сшивается с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека и животных. Экспрессируемый ген встраивается в геном бактериальной или животной клетки, которая начинает синтезировать не свойственное ей ранее вещество, кодируемое экспрессируемым геном. В качестве продуцентов протективного антигена используют микроорганизмы E. coli, B. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Штаммы некоторых продуцентов способны переключать на подобный синтез чужеродного вещества до 50 % своих синтетических возможностей (эти штаммы называются суперпродуцентами).
Иногда к генно-инженерным вакцинам добавляется адъювант. Например, к вакцинам против гепатита В (типичная векторная вакцина), сифилиса, холеры, бруцеллеза, гриппа, бешенства. Антирабическая вакцина – классическая векторная вакцина, антигены которой образуются in vivo, получена на основе вируса осповакцины. Применяется в профилактике бешенства у диких животных с помощью приманки, содержащей эту вакцину.
12. Синтетические вакцины. Содержат искусственно синтезированные короткие пептиды, имитирующие небольшие участки протективных антигенов вируса, способные вызвать специфический иммунный ответ организма. Это возможно при полной расшифровке структуры протективных антигенных детерминант (последовательности аминокислот). Такие вакцины получают с помощью автоматических синтезаторов. У синтетических вакцин слабая антигенная активность, и для усиления иммуногенности они нуждаются в соединении с белком-носителем или синтетическим биополимером (мурамилпептидом, сополимерами D-глутамина и др.).
Как индукторы иммунитета у животных синтетические пептиды впервые опробовали при ящуре. Белок VP-1 вируса ящура – антиген, вызывающий в организме животных выработку вируснейтрализующих антител. Был синтезирован пептид, содержащий аминокислотные последовательности VP-1, который объединили с гемоцианином и адъювантом Фрейнда. Морские свинки, свиньи и КРС, вакцинированные данным препаратом, были устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса ящура даже при низком поствакцинальном титре антител. Положительные результаты получены при применении синтетических вакцин против гриппа, гепатита В, полиомиелита и других болезней.
13. Анатоксины. Представляют собой полученные из бактериальных экзотоксинов препараты, полностью лишенные токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. При приготовлении анатоксинов культуры бактерий – возбудителей токсинемических инфекций, продуцирующих экзотоксины, выращивают в жидких питательных средах (в реакторах большой емкости) для накопления токсина, а затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных тел. К фильтрату добавляют 0,3–0,4 % формалина и помещают смесь в термостат при температуре 37–40 °С на 3–4 недели до полного исчезновения токсических свойств. Полученный анатоксин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность.
14. Конъюгированные вакцины. Представляют собой комплекс бактериальных полисахаридов и токсинов. При таком сочетании усиливается иммуногенность полисахаридных антигенов. С положительным результатом апробированы конъюгированные вакцины в виде сочетания антигена Haemophilus influenzae и дифтерийного анатоксина.
15. Синтетические пептидные вакцины. Метод химического синтеза позволяет получить синтетический пептид – аналог главной антигенной детерминанты протективного антигена (белка) патогенных микроорганизмов. Такой синтетический пептид используется для производства вакцин.
У данных вакцин высокая степень стандартности, слабая реактогенность, и они безопасны. С помощью таких вакцин можно избежать развития аутоиммунных процессов при иммунизации, а при использовании доминантных пептидов – получить вакцины против возбудителей с высокой степенью изменчивости.
Однако у синтетических пептидных вакцин есть и недостаток – слабая иммуногенность вследствие малого размера синтетических пептидов. Усиливают иммуногенность таких пептидов за счет связывания их с высокомолекулярными носителями (полиэлектролитами, полисахаридами, анатоксинами). В качестве высокомолекулярных носителей и адъювантов используются микросферы и липосомы, внутрь которых или к поверхности их мембран прикрепляются антигены. Микросферы – это защитные полимеры, подвергающиеся в организме гидролизу. Липосомы – пузырьки с двуслойной мембраной, состоящей из фосфолипидов. Размеры липосом варьируются от 0,01 до 150 мкм. Это способствует снижению токсичности антигенов и более продолжительной их циркуляции в организме. По мере распада микросфер и липосом антиген дозированно, от нескольких дней до нескольких месяцев, выделяется в организм, и происходит последовательная и постепенная иммунизация особи. Подобные вакцины имеются против гепатита А и гриппа.
16. ДНК-вакцины. Принцип иммунизации с их использованием состоит в том, что в организм вводят не вирусный антиген, а ДНК, кодирующую синтез этого антигена (белка), т. е. сама ДНК используется как вакцина. И ранее было известно, что ДНК и РНК многих вирусов, инфицируя клетки, могут осуществлять полный цикл репликации.
Для иммунизации используют рекомбинантную ДНК как таковую или гибридную плазмиду, содержащую ген протективного антигена. При разных способах введения гибридная плазмида может проникать в клетки, экспрессировать нужный белок и при этом долго сохраняться в организме, что завершается формированием полноценного иммунного ответа. ДНК-вакцины индуцируют выработку антител (гуморальный иммунитет) и специфический цитотоксичный ответ (клеточный иммунитет), что ранее было достижимо только с помощью живых вакцин.
17. Антиидиотипические антитела (вакцины). Многие фрагменты активных центров антигенов имеют пространственное сходство с антиидиотипическими антителами против них, поэтому данные антитела можно использовать как вакцинный антиген, что сразу исключает патогенные и вирулентные свойства возбудителя.
Вакцины из антиидиотипических антител не реактогенны, безвредны и иммунны. Возможно образование Т-, В-эффекторов, Т-, В-клеток иммунологической памяти, обусловливающих защиту против данного антигена.
Антиидиотипические антитела были получены для индукции иммунного ответа к вирусам гриппа и диареи КРС.
18. Вакцины, содержащие продукты генов гистосовместимости. Пептиды приобретают выраженную иммуногенную активность после взаимодействия с антигенами генов гистосовместимости классов I или II. Приняв это как аксиому, исследователи разработали ГКГ-рестриктивные вакцины для лечения людей с гепатитом В, цитомегаловирусной и папилломавирусной инфекцией и с онкологическими заболеваниями (меланома, рак простаты).
Данные вакцины представляют собой комплекс антигенов гистосовместимости класса I с антигенами вируса гепатита В или возбудителя цитомегаловирусной инфекции.
19. Мукозальные вакцины. Разработаны как средства, препятствующие колонизации возбудителями инфекционных заболеваний поверхности слизистых оболочек. В таких вакцинах основу составляет белок адгезин, находящийся на концах пилей, с помощью которых бактерии прикрепляются к поверхности слизистой. Введение такого адгезина сопровождается образованием антител, препятствующих колонизации бактерий и развитию инфекционного процесса.
20. Растительные вакцины. Создаются на основе трансгенных растений. Генная инженерия позволяет внедрить нужные гены почти во все сельскохозяйственные культуры. Экспрессия протективного антигена в растение вызывает в нем стабильные генетические трансформации.
Такие трансгенные пероральные вакцины приводят к формированию системного гуморального и клеточного иммунитета, а также к развитию местного иммунитета кишечника.
Пример – вакцина в виде картофеля, в который экспрессирован антиген энтеротоксигенной кишечной палочки.
21. Рибосомальные (субклеточные) вакцины. Производятся из имеющихся в каждой клетке бактериальных рибосом соответствующего возбудителя. Рибосомы – это органеллы, продуцирующие белок по матрице и-РНК. Выделенные в чистом виде рибосомы с матрицей и представляют собой вакцину.
Примеры – бронхиальная и дизентерийная вакцины (ИРС-19, Бронхомунал, Рибомунил), а также вакцины против сальмонеллеза, эшерихий, стрептококков, гемофилл, франциселл, бруцелл, лептоспир и др.
Авторы:
В. А. Бакулин, профессор, заведующий отделом вирусологии и опухолевых болезней птиц, Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства – филиал Федерального научного центра «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» Российской академии наук (ВНИВИП – филиал ФНЦ ВНИТИП РАН), Санкт-Петербург
А. С. Дубовой, старший научный сотрудник отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц, ВНИВИП – филиал ФНЦ ВНИТИП РАН, Санкт-Петербург
Г. Н. Самусева, старший научный сотрудник отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц, ВНИВИП – филиал ФНЦ ВНИТИП РАН, Санкт-Петербург
