В рамках научно-исследовательской работы в Референтной лаборатории по АЧС подведомственного Россельхознадзору ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработаны методические рекомендации по выявлению РНК вируса классической чумы свиней (КЧС) с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием внутреннего контрольного образца.
Несмотря на то, что в ряде стран КЧС успешно ликвидирована, а для профилактики инфекции, в том числе в Российской Федерации, используются эффективные живые вакцины, риск эмерджентного трансграничного заноса инфекции достаточно велик, особенно на приграничных к неблагополучным территориях (напр. Приморский край). Проведение оперативного пассивного мониторинга КЧС в популяции дикого кабана с использованием методов молекулярно-генетического анализа позволит своевременно реагировать на потенциальные угрозы для отрасли свиноводства региона.
Современные тест-системы на основе ПЦР-РВ имеют максимальную аналитическую чувствительность – 1,5±0,5 lg ККИД50/мл. Более высокий уровень аффинности праймеров, кДНК-мишени и биостабильности достигается модификацией олигонуклеотидов в LNA (замкнутая нуклеиновая кислота). Актуальность разработки этой методики определяется использованием праймеров LNA, модифицированных к фрагменту генома вируса КЧС, которые позволили достичь высокой чувствительности.
Для подбора праймеров был проведен молекулярно-генетический и филогенетический анализы с определением консервативных участков генома. TaqMan-зонды к целевому фрагменту КЧС были подобраны на зеленый флуоресцирующий канал (флуорофор FAM), а к внутреннему контрольному образцу — на crimson (флуорофор Сy5.5).
Новизна методических рекомендаций заключается в применении метода ОТ-ПЦР в реальном времени с добавлением внутреннего контрольного образца для выявления РНК вируса КЧС в различных биологических материалах и изделиях свиного происхождения, а также крови домашних свиней и диких кабанов, а также оптимальном подборе температурно-временных параметров реакции и компонентного состава реакционной смеси на основе отечественных реагентов с целью эффективного обнаружения инфекционного агента.
Источник ВНИИЗЖ
