Генная инженерия сложных кормовых ферментов в семенах ячменя для прямого использования в кормах для животных

Краткое содержание

В настоящее время кормовые ферменты в основном получают путем ферментации грибов, бактерий и других микроорганизмов. Хотя технология производства кормовых ферментов быстро развивалась, активность этих ферментов снижается в процессе гранулирования, а стоимость их применения со временем увеличивается. Альтернативный подход – использование генетически модифицированных растений, содержащих сложные кормовые ферменты, для прямого использования в кормах для животных. Мы совместно экспрессировали три широко используемых кормовых фермента (фитазу, β-глюканазу и ксиланазу) в семенах ячменя, используя метод трансформации, опосредованной Agrobacterium , и создали новую зародышевую плазму ячменя. Результаты показали, что эти ферменты были стабильны и не влияли на развитие семян. Добавление в основной рацион кур-несушек всего 8% семян, содержащих ферменты, снизило количество неперевариваемых углеводов, улучшило доступность фосфора и снизило воздействие животноводческой продукции на окружающую среду до такой же степени, как непосредственное добавление экзогенных ферментов в корм. Скармливание несушкам ферментсодержащих семян существенно повышало прочность скорлупы и массу яиц на 10,0–11,3% и 5,6–7,7% соответственно. Кишечная микробиота, полученная от несушек, которых кормили семенами, содержащими ферменты, была изменена по сравнению с контролем, и в ней доминировали Alispes и Rikenella . Таким образом, трансгенные семена ячменя, полученные в этом исследовании, можно использовать в качестве идеального корма для корма животным.

Источник: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13972

Введение

Зерновые являются основным источником энергии и белка в животноводстве и птицеводстве. Ячмень является одним из основных кормовых ингредиентов в рационах животных и в первую очередь добавляется в качестве источника энергии. Стоит отметить, что энергетическая ценность ячменя зависит от содержания крахмала, а не от содержания неперевариваемых некрахмальных полисахаридов (НСП).

Однако ячмень содержит смешанно связанные β(1-3,1-4)-d — глюканы (β-глюканы) и арабиноксиланы, наиболее важные компоненты NSP в зерне (Garcia-Gimenez et al ., 2019 ). Более высокое содержание NSP может снизить использование энергии и питательных веществ у животных с одним желудком, поскольку они не производят достаточного количества эндогенных ферментов, которые могут эффективно расщеплять эти компоненты из-за структуры их желудочно-кишечного тракта.

Домашним животным трудно переваривать и использовать эти НСП из-за высокой вязкости кишечного содержимого; кроме того, НСП действуют как антипитательные факторы, влияющие на переваривание и всасывание питательных веществ, тем самым приводя к выделению слизи и дисплазии у животных (Abdollahi et al ., 2013 ).

В качестве кормовых добавок ферменты широко используются в рационах большинства животных. Добавление экзогенного фермента может помочь животным разложить антипитательные факторы на небольшие молекулярные фрагменты, высвободить инкапсулированные питательные вещества, снизить вязкость химуса и обеспечить полное переваривание и всасывание питательных веществ (Ward, 2021 ) .

Например, добавление ксиланазы в рационы свиней повышает пищевую ценность (Moran et al ., 2016 ), а добавление ксиланазы и фитазы в рацион на основе обезжиренных рисовых отрубей (DORB) улучшает физиологический статус и показатели роста Labeo rohita ( Ранджан и др ., 2017 , 2018а , б , 2021 , 2022 ). Однако, хотя многочисленные ферменты доступны из животных и растений, стоимость их экстракции высока, а производство ограничено (Holme et al ., 2012 ; Ramos and Malcata, 2017 ). В настоящее время кормовые ферменты обычно получают путем ферментации грибов, бактерий и других микроорганизмов.

Микробная ферментация имеет множество преимуществ, включая использование широкого источника сырья, высокую урожайность, отсутствие сезонных ограничений и подходит для крупномасштабного производства (Чжао и др. , 2015 ) . Следует отметить, что технология производства выделения кормовых ферментов после ферментации не только удорожает применение кормовых ферментов, но и приводит к резкому снижению активности этих ферментов. Кроме того, в процессе гранулирования сырье подвергается воздействию высоких температур, высокой влажности и экструзии.

Исследования показали, что высокие температуры могут приводить к разрыву некоторых вододиспергирующих связей в молекулах белков-ферментов, в конечном итоге изменяя их молекулярную конформацию (Коприва и Чу, 2018; Borgi et al . , 2015 ) . Альтернативным подходом является использование генетически модифицированных растений, содержащих кормовые ферменты, для прямого использования в кормах для животных.

Кроме того, экспрессия рекомбинантных ферментов в растениях может стать более экономически эффективным выбором, чем независимая микробная ферментация, за счет уменьшения ограничений массопереноса при распределении фермента по сложной полимерной матрице субстрата и снижения стоимости грануляции (Shen et al . , 2012 ; Чжан и др ., 2011 ).

Быстрое развитие технологий генной инженерии растений привело к появлению хорошо развитых растительных платформ биопроизводства рекомбинантных белков. Эти платформы в основном включают трансгенные растения на основе листьев и семян. В зависимости от их функций и применения рекомбинантные белки растительного происхождения обычно подразделяют на два класса: терапевтические белки и промышленные ферменты (Xu et al ., 2012 ).

Табак и салат являются ведущими растениями-хозяевами для экспрессии рекомбинантных белков на листьях (Boyhan and Daniell, 2011 ). Действительно, ферменты, введенные в табак и салат, были подвергнуты клиническим исследованиям на людях (Daniell et al ., 2022a , b ; Park et al ., 2020 ; Tremblay et al ., 2010 ). Например, вариант секреторного антитела Гая 13 был получен в выращенных в поле листьях табака (Xu et al ., 2012 ).

Несколько вакцинных антигенов были успешно получены биопродуцированием посредством экспрессии в салате (Kwon and Daniell, 2015 ). В недавнем исследовании сообщалось, что новая недорогая бустер-вакцина, не содержащая холодовой цепи и полиовируса, была биопродуцирована в хлоропластах салата путем экспрессии капсидного белка полиовируса (VP1), слитого с нетоксичной для холеры B-субъединицей (CTB) (Daniell et al . ., 2016 ).

Помимо терапевтических белков, многие промышленные ферменты, в том числе ксиланаза, глюканаза, фитаза, пектиназы, липаза, маннаназа, эндоглюканаза и экзоглюканаза, также были успешно экспрессированы в листовых растениях, что позволило получить полнофункциональный продукт. Например, Панталеони и др . ( 2014 ) получили термостабильную ксиланазу в табаке с помощью молекулярного выращивания хлоропластов; Зиглер и др . ( 2000 ) успешно экспрессировали термостабильную эндо-1,4- d -глюканазу из Acidothermus cellulolyticus в апопласте табака, что привело к накоплению больших количеств фермента для коммерческой конверсии биомассы.

Было обнаружено, что фитаза биологически активна и накапливает до 2,3% общего растворимого белка в листьях табака за счет сверхэкспрессии термостабильной фитазы из Aspergillus fumigatus (Wang et al ., 2007 ). Дэниел и др . ( 2019a , b ) и Кумари и др . ( 2019 г.) произвела коммерческие ферменты листьев (пектиназы, липазу, маннаназу, эндоглюканазу и экзоглюканазу) с использованием новой платформы для производства листьев.

Хотя терапевтические белки и промышленные ферменты, экспрессируемые в листовых растениях, стабильны при температуре окружающей среды, не теряя своей активности (Chan et al ., 2016 ; Chatterjee et al ., 2010 ; Daniell et al ., 2016 ; Pantaleoni et al ., 2014 ). , существует множество случаев наличия рекомбинантных белков в листьях с проблемами, связанными с накоплением. Урожайность растений, выращенных в полевых условиях, может сильно варьироваться из-за воздействия на окружающую среду, что приводит к большему рассмотрению роста в более контролируемых условиях (например, под пластиком или в теплицах). Кроме того, собранный материал имеет ограниченный срок хранения и, следовательно, требует немедленной обработки после сбора для обеспечения стабильности и качества белка (Xu et al ., 2012 ).

Экспрессия рекомбинантного белка, нацеленная на семена растений, может преодолеть ограничения, связанные с тканью листьев (Boothe et al ., 2010 ; Lau and Sun, 2009 ; Ma et al ., 2003 ). Некоторые зерновые культуры, включая рис, пшеницу, ячмень, сою и кукурузу, обычно используются в качестве хозяев для экспрессии (Ramessar et al ., 2008a , b ).

Высокое содержание белка в семенах (от 7% до 10%) привело к высокой экспрессии нескольких белков, нацеленных на семена. Белки, экспрессируемые в семенах, также стабильны, и хранение в течение более 3 лет при комнатной температуре (дольше при хранении в холодильнике) приводило к минимальной потере активности белка.

Преимущества системы производства на основе семян включают простоту хранения белка и возможность применять продукт непосредственно в промышленных процессах, сводя к минимуму манипуляции с ферментами (Boothe et al ., 2010 ; Hood, 2002 ). Таким образом, многие кормовые ферменты экспрессируются в семенных растениях. Например, Чжан и др . ( 2013 ) сообщили, что экспрессия и локализация эндо-β-1,4-глюканазы в различных органеллах эмбриональной ткани трансгенных семян кукурузы были восстановлены на уровнях, равных коммерческим количествам.

Было обнаружено , что специфичная для семян кукурузы сверхэкспрессия гена фитазы Aspergillus niger ( PhyA2 ) полностью удовлетворяет требованиям кормовой промышленности (Chen et al ., 2008 ). Экспрессия трансгена ксиланазы под промотором GluB-1 наблюдалась только в развивающихся зернах, а не в тканях листа, стебля или корня. Патель и др . ( 2000 ) обнаружили, что ксиланаза накапливается и стабильно сохраняется в зерне во время созревания зерна и послеуборочного хранения.

Накопленные данные свидетельствуют о том, что для разработки кормовых ферментов подходит мультиферментный препарат, а не один фермент, поскольку кормовые ингредиенты имеют сложную структуру с различными связями с белками, жирными кислотами, сырой клетчаткой и другими сложными углеводами и полисахаридами ( Choct, 2006 ; Оджха и др ., 2019 ). Например, добавление смеси β-глюканазы и β-ксиланазы в рационы на основе ячменя увеличивало использование питательных веществ, тем самым приводя к улучшению показателей роста птицы (Munyaka et al ., 2016 ).

Таким образом, простое добавление ксиланаз в рационы на основе пшеницы для разрушения арабиноксилановых комплексов не может принести полной пользы. Тем не менее, было обнаружено, что комбинация ксиланазы и фитазы в рационах бройлеров на основе пшеницы обеспечивает полную пользу в отношении питательных веществ, их использования и показателей роста (Selle et al ., 2009 ).

Это можно объяснить тем фактом, что в мультиферментных препаратах активность одного типа ферментов может быть улучшена за счет действия другого фермента за счет увеличения площади контакта с субстратом или снижения вредного воздействия субстратов на использование питательных веществ. Например, Коуисон и Адеола ( 2005 ) сообщили, что фитаза оказывает аддитивный эффект в рационах бройлеров с маргинальной питательной ценностью при смешивании с протеазой и карбогидразой.

В последние годы хорошие результаты получили многие трансгенные растения, экспрессирующие отдельные кормовые ферменты, используемые в качестве кормовых добавок для прямого использования в кормах для животных. Например, трансгенный рис, кукуруза и канола, сверхэкспрессирующие фитазу бактериального происхождения, добавленные в корм для домашней птицы, привели к значительному улучшению пищевой ценности и значительному снижению выведения фосфора (Chen et al., 2013; Hamada et al . , 2006 ; Hong и др ., 2004 ; Няннор и др ., 2007 ; Чжан и др ., 2000 ).

Цыплята-бройлеры, которых кормили β-глюканазой из трансгенного картофеля, экспрессирующей β-глюканазу из Fibrobacter succinogenes , значительно улучшали конверсию корма и снижали вязкость пищеварения в подвздошной кишке (Baah et al ., 2002 ). Экспрессия ксиланазы из Streptomyces olivaceoviridis в трансгенном картофеле обеспечивает альтернативу современным добавкам ксиланазы в корма для животных (Yang et al ., 2007 ).

Что еще более важно, использование зерна ячменя в качестве инструмента для производства кормовых ферментов оказалось благоприятной стратегией, поскольку это орган растения, богатый белком, в количестве от 8% до 15% в пересчете на сухой вес (Holme et al . , 2017 ). Кроме того, определенные кормовые ферменты в зерне ячменя могут улучшить качество солода и корма. Например, Хан и др . ( 2016 ) обнаружили, что сверхэкспрессия гена изофермента EII (1,3;1,4)-β-глюканазы ( HvGlb2 ) ячменя приводит к значительному снижению количества (1,3;1,4)-β- d -глюкана . в ячменных зернах. Холм и др . ( 2017 ) разработали линию трансгенного ячменя, в которой порошкообразная солома использовалась непосредственно в качестве добавки к корму для птицы.

Хотя предыдущие работы по экспрессии однокормовых ферментов в зерне ячменя были успешными (Han et al ., 2016), лишь небольшое количество исследований изучало производство мультиферментов в зернах ячменя на коммерческом уровне. В настоящее время ксиланаза и β-глюканаза являются двумя основными ферментами, переваривающими NSP, используемыми в промышленности кормов для животных.

Ксиланазы расщепляют арабиноксиланы, которые повсеместно встречаются в зерновых, а также их побочные продукты, тогда как β-глюканаза расщепляет β-глюканы и их побочные продукты, которые широко распространены в ячмене. Фитаза широко используется в качестве кормовой добавки для высвобождения фосфата, заключенного в фитате, основной форме хранения фосфора в зерновых культурах, что в конечном итоге делает его доступным для животных с однокамерным желудком.

Таким образом, основная цель этого исследования состояла в том, чтобы экспрессировать смесь ферментов (фитазы, β-глюканазы и ксиланазы) в системе на основе семян ячменя с главной целью — обеспечить их высокий уровень накопления в зерне и снизить стоимость производства. производства для достижения целевого показателя затрат в кормовой промышленности.

Полученные результаты

Создание трансгенных растений

Насколько нам известно, нет сообщений об экспрессии трех или более ферментов в семенах ячменя. Многие факторы, особенно модификация гена и выбор промотора для генерации информационной РНК (мРНК), оказывают существенное влияние на достижение высоких концентраций ферментов в семенах. Таким образом, все гены были модифицированы предпочтительными растительными кодонами, химически синтезированными с помощью метода точного синтеза (PAS) на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Xiong et al .,  2006 ). Кроме того, для конструирования кассеты каждого гена фермента использовали промотор гена глютелина GluB-1 из риса и терминатор NOS (нопалинсинтазы). Впоследствии каждый ген был бесшовно связан с промотором и терминатором с использованием модифицированного метода перекрывания-удлинения (Peng et al .,  2006 ; Рисунок  1a ).

Трансгенные растения ячменя были получены путем совместного культивирования зрелого зиготического незрелого фуражного ячменя с A. tumefaciens . Из соматических эмбрионов выделено более 50 устойчивых к гигромицину линий. Наконец, три трансгенные линии были получены путем идентификации признаков сегрегации трансгенных семян.

Экспрессия ферментов в трансгенном ячмене

Результаты анализа RT-PCR показали относительно высокие уровни экспрессии мРНК YmAPPA , PceglA и AkxynC в зрелом эндосперме трех трансгенных линий 565-1, 564-6 и 565-16 (рис.  S1 ). Однако в ячмене дикого типа (WT) мРНК трех генов не была обнаружена.

Гетероэкспрессируемый белок в трансгенных линиях определяли с помощью вестерн-блот-анализа. Неожиданно фитаза из семян показала большую обнаруживаемую полосу при вестерн-блоттинге (приблизительно 60 кДа). После обработки эндогликозидазой Н фермент имел примерно ту же молекулярную массу, что и белок дикого типа (46 кДа). Примечательно, что предсказанная фитаза имела относительно высокое содержание сайтов гликозилирования, что способствовало стабильности фитазы при экспрессии в Pichia Pastoris . Полноразмерный ген PceglA , трансформированный в ячмене в этом исследовании, также продуцировал гликозилированный белок, размер которого превышал расчетный. Кроме того, ген AkxynC кодировал белок массой примерно 24 кДа в семенах ячменя (рис.  1b ).

На рисунке  2 показаны накопленные уровни трех ферментов в трех трансгенных линиях. Результаты показали, что семена трансгенной линии 565-1 проявляли самую высокую активность фитазы при 4000 ЕД/кг (рис.  2б ). Все положительные семена в трех линиях также показали более высокую активность β-глюканазы и ксиланазы со значением ≥26 000 Ед/кг (рис.  2c,d ). Для успешного производства кормовых ферментов из зерна ячменя важным аспектом является стабильность фермента в зерне во время послеуборочного хранения. На рисунке  2 показано, что активность всех трех кормовых ферментов была стабильной в течение как минимум 6 месяцев даже при 37 °C. По количеству кормовых ферментов в обычных полноценных кормах вышеуказанным требованиям отвечали семена ячменя, добавляемые в комбикорм в количестве 8% (Сломинский,  2011 ).

Оценка агрономических показателей

Результаты сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показали, что трансгенный ячмень морфологически неотличим от ячменя дикого типа, выращенного в идентичных условиях. В частности, не было различий в структуре крахмала трансгенных растений и семян дикого типа (рис.  3а ). Более того, не было значительной разницы в массе 1000 зерен или скорости прорастания семян между трансгенными растениями и растениями дикого типа (рис.  3b,c ). Однако содержание фитиновой кислоты и β-глюкана было значительно снижено в трансгенном ячмене (рис.  3d,e ). По сравнению с ячменем дикого типа содержание фитиновой кислоты и β-глюкана в трансгенном ячмене снизилось примерно на 37% и 84% соответственно. Белок является одним из основных компонентов зерна, влияющим на питательность. Общий белок определяли количественно, чтобы определить влияние повышенного содержания кормовых ферментов в трансгенных семенах на питательные качества ячменя. Как показано на Фигуре  3f , содержание белка в трансгенных семенах находилось в тех же пределах, что и в семенах дикого типа. Результаты показали, что повышенное содержание кормовых ферментов в семенах, по крайней мере, не снижает их питательную ценность.

Влияние экспрессии комплекса ферментов на показатели роста животных

На протяжении многих лет ферменты и фитазы NSP, полученные микробным путем, широко использовались в индустрии кормов для животных в форме одного или нескольких ферментов. Таким образом, было проведено испытание кормления животных для оценки влияния на показатели роста животных комплексных кормовых ферментов, выраженных в трансгенной инбредной линии ячменя 565-16. Для этого в базовый рацион животных добавляли муку, полученную из трансгенных семян. Результаты показали, что несушки, получавшие основной рацион (контрольная группа), уступали курам, получавшим основной рацион, в котором ячмень дикого типа был заменен трансгенным ячменем, содержащим ферменты (группа ТВЕ). Прочность яичной скорлупы в группе КЭ после 15–20 дней кормления увеличилась на 10,0–11,3% (рисунок  4b ), уровень, который был аналогичен уровню в группе, получавшей основной рацион, содержащий корм, смешанный с экзогенными кормовыми ферментами. (группа EXE; 250 ед. фитазы, 2000 ед. β-глюканазы и 2500 ед. ксиланазы). Масса яиц из группы КЭ также увеличилась на 5,6–7,7% по сравнению с контрольной группой (рис.  4а ).

Затем мы исследовали относительную усвояемость и содержание общего фосфора, β-глюкана и сырой клетчатки в фекалиях, полученных от различных групп (контрольная группа, группа EXE и группа TBE) на этапах выращивания. Содержание сырой клетчатки и фосфора в фекалиях контрольной группы было значительно выше, чем в других группах на этапах выращивания ( P  <0,05; Рисунок  4c,d ). После кормления смешанным ферментным ячменем (группа TBE) кажущаяся относительная перевариваемость общего фосфора улучшилась по сравнению с контрольной группой (рис.  4d ). Экскреция фосфора с фекалиями у группы КЭ снизилась на 50% и более по сравнению с контрольной группой. Однако после кормления в течение 28 дней не было существенной разницы между группой TBE и группой EXE (рис.  4d ). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что трансгенный ячмень при использовании в качестве корма для животных был очень эффективен в снижении выделения фосфора несушками. Следует отметить, что содержание β-глюкана в фекалиях группы КЭ также было значительно ниже, чем в контрольной группе . Хотя между группой EXE и группой TBE наблюдалась значительная разница в содержании β-глюкана в фекалиях, относительная усвояемость β-глюкана между ними была почти одинаковой. Кроме того, относительная усвояемость сырого белка между группами EXE и TBE была немного выше, чем в контрольной группе, поскольку фитаза действует на белок-фитатный комплекс и делает белок доступным для биологической активности (Biradar et al., 2017 ;  Рисунок 4f  ) . .

Влияние трансгенного ячменя на кишечную микрофлору кур-несушек

Эксперимент с микробиомом кишечника показал, что общее количество Firmicutes и Bacteroidetes в кишечнике значительно изменялось независимо от того, добавлялись ли в корм экзогенные ферменты или трансгенные семена ячменя. Более низкое соотношение видов Firmicutes и Bacteroidetes было обнаружено в слепой кишке кур-несушек после кормления смесью ферментов (рис.  5а ). Соотношение Firmicutes / Bacteroidetes снизилось с 63,7% до 41,1% или до 39% после добавления ферментов в основной корм с использованием трансгенных семян ячменя или экзогенных ферментов соответственно.

Кроме того, для выявления важных таксономических различий между тремя группами использовался логарифмический пороговый балл LDA (линейный дискриминантный анализ), равный 2,0. Результаты анализа LDA LEfSe (размер эффекта линейного дискриминантного анализа) показали заметную разницу в кишечных микроорганизмах между группами КЭ и контрольной группой. Относительная численность родов Alispes и Rikenella была выше в группе TBE, чем в контрольной группе, тогда как относительная численность Treponema была выше в контрольной группе, чем в группе TBE (оценка LDA> 2, рисунок  5b,c ). Примечательно, что конкретный вид бактерий может быть предсказателем реакции на конкретную диету. Между группами TBE и EXE не было обнаружено существенных различий.

Характеристика генов, обогащенных кишечным микробиомом в группах TBE и контрольной группе, выявила отчетливое усвоение питательных веществ кишечным микробиомом, на которое в значительной степени повлияли различные особенности питания хозяина (рис. 5d-f  ) . Микробиом кишечника животных группы КЭ был обогащен генами метаболизма ароматических аминокислот и биосинтеза витаминов В1 и В7. Кроме того, гены, участвующие в транспортерах АТФ-связывающей кассеты (ABC) и биосинтезе антимикробных пептидов и антибиотиков (например, биосинтез орнитина и тетраценомицина), а также в насосе оттока нескольких лекарств, также были обогащены кишечным микробиомом группы TBE. Некоторые ферменты, участвующие в репарации ДНК, также были обогащены кишечным микробиомом группы TBE. Более того, гены, обогащенные кишечным микробиомом контрольной группы, были в первую очередь генами, нацеленными на анаэробное производство энергии (метаболизм метана), метаболизм углеводов (гликолиз и пути Энтнера-Дудорова) и метаболизм липидов, включая ферменты синтеза сфингозина и церамидов. Разница между генами, обогащенными кишечным микробиомом КЭ и контрольных групп, может быть вызвана разложением фитиновой кислоты в корме смешанным ферментом ячменя, что улучшает всасывание питательных веществ в кишечном тракте животных и, таким образом, приводит к в серии генных изменений. Например, комплексы фитата кальция реагируют с жирными кислотами с образованием нерастворимых сапонинов в кишечнике в процессе переваривания липидов (Ellis et al .,  1982 ). Фитаты также могут соединяться с крахмалом, ингибируя действие амилазы и снижая усвояемость углеводов (Ленкова и др .,  2020 ; Selle et al .,  2000 ). Таким образом, контрольной группе трудно нормально метаболизировать липиды и углеводы в кишечнике в контрольной группе из-за наличия фитиновой кислоты, тогда как эти питательные вещества могут нормально метаболизироваться в группе ТВЕ из-за фитазно-опосредованного разложения фитиновой кислоты. Кроме того, бета-глюкан в поврежденных тканях, таких как клетки лимфоидной ткани, ускоряет выработку цитокинов, делая более эффективными другие лекарства, включая антибиотики, противогрибковые и противопаразитарные препараты (Angeli et al. , 2006  ) . Следовательно, когда β-глюкан расщеплялся β-глюканазой в группах КЭ, эти специфические функции были затронуты. Это привело к высокой экспрессии генов, участвующих в биосинтезе антимикробных пептидов и антибиотиков, а также некоторых ферментов, участвующих в репарации ДНК в микробиоме кишечника групп КЭ.

Обсуждение

Ячмень, одна из основополагающих сельскохозяйственных культур, является четвертым по значимости зерновым зерном в мире, его производство превышает 130 миллионов метрических тонн в год (Mrizová et al .,  2014 ). Примечательно, что около 66% семян ячменя, производимых в мире, используется на корм животным. Однако клеточные стенки эндосперма зерен ячменя характеризуются наличием (1,3;1,4)-β- d -глюканов и арабиноксиланов, двух основных антипитательных веществ у животных с однокамерным желудком, которые, как было показано, увеличивают вязкость химуса и снижают скорость переваривания и всасывания питательных веществ в тонком кишечнике (Perera et al .,  2019 ). Кроме того, около 70% общего количества фосфатов в семенах хранится в виде фитиновой кислоты. Большая часть этой фитиновой кислоты не переваривается животными с однокамерным желудком и поэтому выделяется с фекалиями и смешивается с сельскохозяйственными почвами, где в конечном итоге диффундирует в водную среду в качестве загрязнителя, что приводит к росту водорослей и эвтрофикации. Это можно объяснить тем, что у животных с однокамерным желудком отсутствует кишечный фермент для освобождения фосфатных групп из фитиновой кислоты (Gupta et al .,  2015 ; Perera et al .,  2018 ).

Учитывая, что кормовые ингредиенты имеют сложную структуру, мультиферментный препарат, а не один фермент, обеспечивает реальный подход к улучшению использования питательных веществ в рационах скота и птицы (Juanpere et al. , 2005  ) . Стоит отметить, что если семена злаков содержат достаточное количество различных ферментов, нет необходимости в добавлении микробных ферментных добавок. Корм без добавок значительно снижает затраты на корм и упрощает обработку корма и составление рациона. Однако существует лишь несколько исследований по производству комплексных кормовых ферментов в семенах зерновых. В этом исследовании мы продемонстрировали, что трансгенные семена ячменя могут экспрессировать фитазу, β-глюканазу и ксиланазу вместе в эндосперме, не влияя на прорастание семян. Активность фитазы в трансгенных семенах достигала около 4000 ЕД, тогда как активности β-глюканазы и ксиланазы достигали около 26 000 ЕД/кг семян. Испытания по кормлению показали, что добавление 8% трансгенных семян, содержащих три кормовых фермента, в основной рацион заменяет содержание мультиферментных добавок для несушек и обеспечивает эквивалентный эффект на качество яиц и использование питательных веществ.

Худ и др . ( 2012 ) сообщили, что семена растений обладают такими преимуществами, как стабильность белка, длительное время хранения, простота транспортировки и низкая стоимость. В этом исследовании активность всех трех кормовых ферментов была стабильной в течение как минимум 6 месяцев. Производство семян растений с кормовыми ферментами позволяет снизить стоимость грануляции и потери ферментов в процессе грануляции. Кроме того, результаты вестерн-блоттинга показали, что трансгенный ячмень экспрессирует фитазу и β-глюканазу с молекулярными массами, превышающими их расчетные значения, что указывает на разные паттерны гликозилирования обоих белков в трансгенных растениях. В целом эти преимущества делают растительную систему экспрессии очень привлекательной для производства промышленных ферментов, особенно тех, которые не требуют очистки, но требуются в больших количествах.

В кормлении скота существует три типа кормовых ферментов, которые обычно используются для разложения клетчатки, белка, крахмала и фитатов. На протяжении многих лет в качестве кормовых добавок использовались многие ферменты, в том числе целлюлазы, β-глюканазы, ксиланазы, фитазы, протеазы, липазы и галактозидазы (Adeola and Cowieson, 2011  ) . Во многом это произошло из-за проблем с экспрессией различных ферментов в одном и том же семени. У зерновых эндосперм является основным местом хранения питательных веществ и запасных белков зерна (Shewry et al .,  2002 ). Гетерологичные белки обычно экспрессируются на высоких уровнях, особенно в эндосперме. В этом исследовании промотор риса GluB-1 , один из наиболее часто используемых эндосперм-специфичных промоторов, использовался для контроля экспрессии трех ферментов, при этом полученные трансгенные семена ячменя проявляли высокую ферментативную активность (Qu and Takaiwa, 2004  ) . . Предыдущие исследования показали, что другие сильные, специфичные для зерна промоторы генов, такие как гордеин B-1 ( HOR2-4 ), гордеин D ( HOR3-1 ) и γ-гордотионин , могут достигать более высоких уровней накопления белков в семенах (Stahl et al. .,  2009а , б ). Это говорит о том, что разные промоторы могут достичь лучших результатов для экспрессии мультиферментной системы в семенах. Однако не все промоторы могут обеспечивать эффективную экспрессию фермента из-за различий в силе промоторов. Следовательно, модификация промоторов и сигнальных пептидов специфичных для семян генов путем перетасовки ДНК поможет найти более подходящих кандидатов для отложения рекомбинантных белков в белковых телах развивающихся клеток эндосперма (Lu and Jeffries, 2007  ) . Кроме того, были использованы промоторы специфических генов других органов семян, таких как промотор α-AMY в алейроновом слое и промотор гена зародышей ячменя Gerb в семенной кожуре (Eskelin et al .,  2009 ; Wu et al .,  2000 ). контролировать экспрессию кормовых ферментов и снижать давление высокоэкспрессируемых белков в семенах. Ян и др . ( 2012 ) предположили, что снижение эндогенных запасных белков семян может быть новой эффективной стратегией повышения уровня накопления желаемых рекомбинантных белков.

Интересно, что мы обнаружили, что богатство и разнообразие кишечной микробиоты были изменены у кур-несушек, которых кормили трансгенным ячменем, по сравнению с несушками в контрольной группе, и этот результат аналогичен тем, которые наблюдались у кур-несушек, которых кормили мультиферментными добавками. Исследования показали, что диета выполняет решающую функцию в формировании и/или изменении микробиома, а изменения микробных сообществ, вызванные диетой, происходят быстро и воспроизводимо (Kolodziejczyk et al., 2019; Yadav and  Jha ,  2019 ). Ферменты могут модулировать микробиоту кишечника, улучшая усвояемость ряда компонентов корма и изменяя питательную ценность рациона (Когут,  2019 ). Например, фитаза привела к значительным изменениям в использовании пищевого известняка и фосфатов. Кроме того, ферменты карбогидразы устраняли инкапсулирующий питательные вещества эффект клеточной стенки за счет разрушения специфических химических связей в кормах и частичного расщепления полисахаридов, тем самым увеличивая доступность крахмалов, аминокислот и минералов (Costa et al. , 2008  ; Jha и др .,  2015 ). Лю и др . ( 2012 ) сообщили, что добавление ксиланазы в рацион на основе пшеницы облегчает нарушение барьера слизистой оболочки кишечника у птиц, зараженных Clostridium perfringens , возбудителем газовой гангрены. Другое исследование показало, что фитаза играет роль в модуляции микробиоты кишечника кур за счет увеличения количества Lactobacillus sp. и Enterococcus sp. в подвздошной кишке (Птак и др .,  2015 ). Здесь мы обнаружили, что добавление мультиферментов в целом усиливает рост бактерий Rikenellaceae ( Alispes и Rikenella ) в слепой кишке кур. Алистипес получал богатую белком диету и регулировал ферментацию белка и синтез насыщенных жирных кислот. Это указывало на то, что основная микробиота кишечного пищеварения изменилась после добавления ферментов в основной рацион. Хотя исследования по изменению микробиоты кишечника при различных рационах проводились (Ptak et al .,  2015 ), взаимосвязь между видовым разнообразием микробиоты кишечника и эффективностью кормления птицы до сих пор неясна. Будущие исследования должны использовать молекулярные технологии для выяснения механизма, посредством которого ферменты оказывают изменения на микробиом кишечника. В частности, комбинированный подход метапротеомики, метатранскриптомики и метаболомики является полезным инструментом для понимания взаимосвязи между кормовыми ферментами и кишечной микробиотой (Робертси др .,  2015 ).

В заключение, совместная экспрессия генов YmAPPA , PceglA и AkxynC в семенах ячменя привела к значительному увеличению активности фитазы, β-глюканазы и ксиланазы. Добавление только 8% трансгенных семян, содержащих ферменты, в основной рацион несушек снизило содержание неперевариваемых углеводов, улучшило доступность фосфора и снизило воздействие животноводства на окружающую среду. В совокупности наши результаты показывают, что трансгенные семена ячменя, полученные в этом исследовании, могут быть использованы в качестве идеального корма для животных.

Методы

Растительный материал, химикаты и стандарты

Семена ячменя (сорт Янмай 3) получены из лаборатории генной инженерии растений Шанхайской академии сельскохозяйственных наук. Трансгенные саженцы были пересажены на рисовое поле в округе Байхэ, район Цинпу, Шанхай, Китай. Стандартные ферменты (фитаза, β-глюканаза и ксиланаза) и фитат натрия были приобретены у Sigma Chemical Co., Ltd (Сент-Луис, Миссури, США). Все остальные химикаты имели аналитическую степень чистоты и были приобретены у компании Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Все праймеры были приобретены у компании Shanghai Sangon Biological Engineering Technology and Service Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Штамм Agrobacterium tumefaciens EHA105 и Escherichia coli DH5α были получены из лаборатории генной инженерии растений Шанхайской академии сельскохозяйственных наук. Набор для выделения РНК был приобретен у Fermentas International, Inc. (Берлингтон, Онтарио, Канада), а система обратной транскрипции была приобретена у Promega (Мэдисон, Висконсин). Двадцать четыре 4-недельные куры-несушки с черным оперением (Синъян) были получены из Национального научно-исследовательского центра птицеводства Министерства сельского хозяйства (Шанхай, Китай).

Выбор ферментов и генов

Ген фитазы HAP, YmAPPA (примечания  S1 и рисунок  S2 ), был выбран из члена семейства Enterobacteriaceae Yersinia mollaretii согласно Shivange et al . ( 2012 ) из-за его специфической активности по отношению к фитату природного субстрата, которая в среднем в десять раз выше, чем обычно используемые/сообщаемые грибковые фитазы. Кроме того, фитазы могут сохранять стабильность в желудочно-кишечном тракте животных во многом благодаря их стабильности в широком диапазоне pH и устойчивости к пепсину.

Ген эндо-β-1,3-1,4-глюканазы ( PceglA , примечания  S1 и рисунок  S3 ) был выделен из Pectobacterium parmentieri согласно Zhu et al . ( 2018 ). Сравнение его аминокислотных последовательностей с последовательностями других β-глюканазы из различных источников показало, что фермент демонстрирует 66% гомологию с лихеназой, полученной из Bacillus licheniformis (EC 3.2.1.73), важной гликозилгидролазой при гидролизе (1,3; 1,4)-β- d -глюканы. Удельная активность очищенного рекомбинантного фермента P. parmentieri была выше, чем у Bacillus spp. Более того, β-глюканаза была более термотолерантной, чем ее аналоги из ячменя, а подходящий диапазон pH для фермента составлял 3,5–4. Примечательно, что высокая термостабильность и кислотный катализатор делают этот фермент подходящим для применения в кормовой промышленности.

Ген ксиланазы ( AkxynC , примечания  S1 и рисунок  S4 ) из Aspergillus kawachii , который используется для изготовления сётю (традиционного японского спиртного напитка), был выбран для экспрессии в ячмене согласно Qiu et al . ( 2016 ). Следует отметить, что AkxynC принадлежит к семейству гликозидгидролаз 11 и что оптимальный pH чрезвычайно ацидофильной ксиланазы составляет 2,8, что намного ниже, чем у бактериального фермента. Кроме того, фермент показал высокую устойчивость к пепсину и трипсину. Чтобы соответствовать pH желудочно-кишечного тракта, фермент был модифицирован с помощью мутаций двух остатков (Thr64Ser и Asp48Asn), что привело к сдвигу его оптимального pH с 2,8 до 5,0 (Qiu et al .,  2016 ).

Векторная конструкция

Чтобы улучшить экспрессию белка в растениях, все кодоны каждого гена ( YmAPPA , PceglA и AkxynC ) сначала были оптимизированы для экспрессии ячменя; последовательности обратных повторов, структуры «стебель-петля» и сигналы терминации транскрипции в генах были удалены для улучшения стабильности РНК; последовательности распознавания интронов в кодирующей области были удалены, чтобы избежать сплайсинга интронов, а олигонуклеотиды C и G во втором и третьем сайтах кодонов были максимально модифицированы, чтобы избежать метилирования в растениях. Затем все гены были химически синтезированы с помощью метода точного синтеза на основе ПЦР (PAS) в соответствии с Xiong et al . ( 2006 ). Первый прямой олигонуклеотид на самом 5′-конце и последний обратный праймер на самом 3′-конце были определены как внешние олигонуклеотиды, тогда как остальные праймеры были определены как внутренние олигонуклеотиды. Мастер-микс ПЦР содержал 1–3 пмоль каждого из внутренних олигонуклеотидов и 10–30 пмоль внешних олигонуклеотидов. ПЦР проводили в течение 25 циклов в следующих условиях: 94 °С – 30 с; 60°С в течение 30 с; и 72°С в течение 1–2 мин с последующим продлением при 72°С в течение 10 мин. Далее химически синтезированные гены были помещены под контроль промотора GluB-1 риса и терминатора NOS . Примечательно, что каждый ген был легко связан с промотором и терминатором, образуя кассеты экспрессии генов. Затем все экспрессионные кассеты были собраны в один и тот же вектор экспрессии pYP694 (Tian et al .,  2020 ) с использованием изокаудомеров. Конечный вектор (pYP69- YmAPPA — PceglA — AkxynC ), названный pAPPAXYNCEG, нес три гена пищевых ферментов и ген устойчивости к гигромицину ( hpt ). Ген hpt находился под контролем промотора CaMV35S и использовался в качестве селектируемого маркера.

Агробактериальная трансформация ячменя

Семена ячменя (сорт Янмай 3) выращивали в почве в естественных условиях и собирали, когда незрелые зародыши (ИЭ) достигали длины примерно 1,5–2,5 мм. Незрелые зародыши выделяли из поверхностно-стерилизованного зерна и затем высевали на среду для индукции каллуса. Затем полученные каллусы трансформировали путем совместного культивирования со штаммом Agrobacterium tumefaciens EHA105, содержащим бинарную экспрессирующую плазмиду (pAPPAXYNCEG), в соответствии с протоколом, описанным Tingay et al . ( 1997 ). После 3-дневного совместного культивирования при 24°С в темноте каллусы тщательно промывали стерильной дистиллированной водой, а затем три-пять раз промывали карбенициллином в концентрации 250 мг/л, промокали на фильтровальной бумаге и высевали на селективную среду ( среду для индукции каллуса, дополненную гигромицином) и инкубировали при 24 °C при слабом освещении в течение 8–10 недель. Устойчивые к гигромицину каллусы затем переносили в регенерационную среду. Наконец, когда побеги достигли 2–3 см длины, их перенесли на среду для укоренения. Затем проростки, полученные из тканевой культуры, пересадили в почву в теплице. Семена трансгенных линий Т ₀ высевали на среду Мурасиге и Скуга (MS), дополненную гигромицином, для определения того, являются ли они положительными растениями. Затем была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) для определения присутствия трех генов для дальнейшего скрининга положительных растений с использованием ДНК в качестве матрицы. И семена Т ₁ трансгенных линий использовали для создания растений Т ₂ . Этот процесс повторяли до поколения Т ₄ для получения гомозиготных линий от исходных растений. Каждое растение дало достаточно семян для дальнейшего анализа.Анализ экспрессии генов

Тотальную РНК экстрагировали из 0,1 г развивающихся зародышей (через 20 дней после опыления) трансгенных линий ячменя (565-1, 564-6, 565-16) с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) согласно инструкции производителя. инструкции. Синтез кДНК первой цепи осуществляли с использованием набора PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa, Киото, Япония). Для полуколичественного обнаружения экспрессии генов с помощью RT-PCR для обратной транскрипции использовали 3 мкг тотальной РНК. ПЦР проводили с использованием Actin2 в качестве внутреннего контроля. ПЦР проводили в следующих условиях: 10 минут при 94 °С, затем 22 цикла по 30 с при 94 °С, 30 с при 56 °С, 30 с при 72 °С и финальное удлинение при 72 °С. в течение 5 мин. Последовательности используемых праймеров перечислены в Таблице  S1 .

Вестерн-блот-анализ

Случайно выбранные зерна измельчали ​​с помощью измельчителя (инструмент QianJiang JSF-13A; Hangzhou Qianjiang Instrument Equipment Co., Ltd., Ханчжоу, Китай) с последующей экстракцией общего количества белков из семенной муки. Вкратце, 20 мг порошка семян помещали в микроцентрифужные пробирки емкостью 1,5 мл и экстрагировали 300 мкл экстракционного буфера (50 мМ лимонная кислота-Na ₂ HPO ₄ , pH 3,5). Пробирки вибрировали при комнатной температуре в течение 1 часа и центрифугировали при 5000  g  в течение 10 минут. Далее супернатанты переносили в свежие пробирки и инкубировали с двукратным объемом предварительно охлажденного ацетона в течение 30 мин. После центрифугирования при 14 000  g в течение 10 мин осадок белка растворяли в 30 мл деионизированной воды. Затем образец белка разделили на две равные части: одну для дегликозилирования эндо-β-N-ацетилглюкозаминидазой (Endo H), а другую оставили интактной. Белки, экстрагированные из нетрансформированного Yangmai 3, использовали в качестве отрицательного контроля. Концентрацию общего белка в зернах ячменя определяли с использованием набора реагентов для анализа белка Micro BCA (Pierce, Рокфорд, Иллинойс, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Вестерн-блот анализировали с помощью поликлональных антител, выработанных у кроликов против фермента, экспрессируемого E. coli . Трем кроликам трижды вводили очищенный белок. После разделения на SDS-PAGE белки переносили на нитроцеллюлозную (NC) мембрану (Bio-Rad, Hercules, CA, США). Специфичность антитела проверяли и разбавляли в 2000 раз для вестерн-блоттинга. В качестве вторичного антитела использовали козий антикроличий IgG, меченный щелочной фосфатазой. Метод подложной электрохемилюминесценции (ECL) был использован для разработки и визуализации результатов под рентгеновскими лучами.

Определение активности фитазы, β-глюканазы и ксиланазы.

Для определения активности фитазы 100 мг порошка семян помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, в которую добавляли 1 мл экстракционного буфера (50 мМ NaAc, 1 мМ CaCl 2 , pH 5,5 ) _. Пробирки перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем центрифугировали при 5000  g в течение 10 минут. Супернатанты переносили в свежие пробирки и использовали для определения активности фитазы, как описано ранее (Wyss et al .,  1999b ). Затем 100 мкл супернатанта смешивали с 900 мкл 5 мМ фитиновой кислоты и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 15% (об./об.) трихлоруксусной кислоты (ТСА). Высвободившийся фосфат определяли количественно с использованием спектрофотометра с раствором, содержащим 0,6 М H ₂ SO ₄ , 2% аскорбиновой кислоты и 0,5% молибдата аммония. В качестве сравнения использовали стандартные растворы фосфата калия. Одну единицу (Е) активности фитазы определяли как величину активности, при которой высвобождалось 1 мкмоль фосфата в минуту при 37°C.

Активность β-глюканазы определяли путем измерения количества редуцирующего сахара, выделившегося из лихенана, методом 3,5-динитросалициловой кислоты (ДНС) (Гусаков и др .,  2011 ). Сырой гомогенат смешивали с ДНС и кипятили 5 мин. После охлаждения смеси количество редуцирующего сахара определяли по поглощению при 540 нм. Одну единицу ферментативной активности определяли как количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль редуцирующего сахара в минуту из 1,0% лихенана в лимонной кислоте-Na ₂ HPO ₄ (50 мМ , pH 3,5) при 60°С в течение 10 мин.

Ксиланазную активность определяли путем измерения количества редуцирующего сахара, высвободившегося из арабиноксилана, как описано ранее (Fushinobu et al .,  2011 ). Вкратце, 10 мкл неочищенного гомогената смешивали с 190 мкл ксилана, суспендированного в 50 мкл цитрата натрия. Смесь инкубировали при 40°С в течение 30 мин. Впоследствии количество высвободившегося сахара определяли на основе поглощения при 490 нм. Одну единицу ксиланазы определяли как количество, которое высвобождало 1 мкмоль эквивалента восстанавливающего сахара из ксилана.

Оценка стабильности ферментов трансгенного зерна при хранении

Стабильность фермента исследовали на зернах гомозиготных линий (565-1, 564-6 и 565-16), хранившихся при различных температурах, и анализировали активность фермента после различного времени хранения.

Определение содержания фитиновой кислоты, β-глюкана, сырой клетчатки и общего белка.

Количество фитиновой кислоты измеряли согласно ранее опубликованному методу (McKie and McCleary,  2016 ). Вкратце, образцы массой 30 мг экстрагировали 1 мл раствора 0,4  м HCl–15% TCA при комнатной температуре в течение 3 часов, а затем центрифугировали при 5000  g в течение 10 минут. Далее 25 мкл супернатанта смешивали с 275 мкл 36,3 мМ NaOH и 100 мкл 0,03% (мас./об.) FeCl ₃ –0,3% сульфосалициловой кислоты. Затем образец центрифугировали при 2000  g в течение 10 мин и определяли его концентрацию путем измерения оптической плотности при 500 нм. Тот же экстракт использовали для определения содержания фосфатов.

Содержание β- d -глюкана определяли с использованием набора для β-глюканов со смешанными связями (кат. K-BGLU; Megazyme International, графство Уиклоу, Ирландия). Перед обнаружением β-глюкана зерна ячменя измельчали ​​в жидком азоте и сушили при 60°C в течение 3 дней. Сырую клетчатку в образцах корма и фекалий определяли количественно с использованием метода фильтрации, как подробно описано в предыдущем исследовании (Lee and Hristov,  2013 ). Общий белок определяли методом Кьельдаля по методу AOAC ( 2007 ) 979,09 с коэффициентом пересчета 5,7.

Анализ морфологии методом сканирующей электронной микроскопии

Отбирали и очищали сухие и зрелые семена. Затем семена разрезали крест-накрест и распыляли золото в вакууме. Затем поперечное сечение семян поворачивали вверх и помещали под сканирующий электронный микроскоп для наблюдения и записи изображений. Сканирующие электронные микрофотографии были получены с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM; S4800; Hitachi, Токио, Япония), как сообщалось ранее (Tian et al .,  2019 ).

Масса зерна и всхожесть семян.

Для определения веса 1000 зерен взвешивали тысячу зерен с каждой линии.

Сто зерен из каждой линии помещали при 25°С в темную камеру для прорастания. Всхожесть оценивали через 5 дней. Все анализы проводились в трех повторностях.

Кормление несушек семенами ячменя, богатыми кормовыми ферментами

Двадцать четыре 4-недельные куры-несушки с черным оперением (Синъян) были случайным образом и поровну разделены на три группы. Контрольная группа получала основной рацион, содержащий 52% кукурузной муки, 27% бобовых, 8% ячменя, 7,5% минеральных элементов и 4% смеси витаминов. Состав и уровень питательности рациона показаны в Таблице  S2 . Диету EXE готовили путем смешивания 250 U фитазы, 2000 U β-глюканазы и 2500 U ксиланазы на килограмм. Диету для тест-группы готовили путем замены ячменя дикого типа на трансгенный ячмень 564-16 (TBE).

Цыплят помещали в трехъярусные клетки в закрытом помещении. Кур-несушек содержали в помещении с фотопериодом 16 часов света, 8 часов темноты, влажностью 45-50% и температурой 25°C. Несушкам давали соответствующий рацион три раза в день в течение 4 недель, при этом еженедельно измеряли потребление корма и массу тела. Все экскременты собирали и сушили в печи с принудительной вентиляцией при температуре 65°C в течение 3 дней, затем измельчали ​​и пропускали через сито с диаметром ячеек 1 мм для последующего анализа. Общий объем экскрементов собирали с 14 по 28 день для определения кажущихся метаболизируемых питательных веществ (AMN) путем измерения количества питательных веществ в рационе и экскрементах, как сообщалось ранее (Chen et al. , 2013  ) .

Сбор образцов и секвенирование кишечного микробиома

Для сбора образцов кишечной ткани от несушек из каждой группы случайным образом отбирали по три цыпленка (9-недельного возраста) и забивали. Слепую кишку собирали и замораживали в жидком азоте.

Бактериальные клетки экстрагировали из образцов ткани кишечника, выделяли дифференциальным центрифугированием и затем лизировали. ДНК микробного генома экстрагировали с использованием мини-набора QIAamp DNA Stool (кат. № 51504; QIAGEN, Дюссельдорф, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки парных концов метагеномной ДНК были приготовлены с использованием вставки размером 150 пар оснований (п.н.), а затем секвенированы на Illumina HiSeq 2500. Качество секвенированных необработанных данных оценивалось с использованием Fastqc. Средняя частота ошибок чистого чтения была ниже 0,001. Кроме того, необработанные чтения были очищены для исключения адаптерных последовательностей и последовательностей низкого качества с помощью Trimmomatic (v0.39). Короткие чтения (длина <35 п.н.) и непарные чтения также были исключены для получения данных с чистыми чтениями.

Для каждого образца качественные чтения собирались в контиги с помощью IDBA_UD (v1.1.2). Читания были всесторонне проанализированы, чтобы выбрать лучшие k-меры. Впоследствии предсказание генов было выполнено на контигах размером более 100 п.н. с использованием Prodigal (v2.6). Неизбыточный каталог генов был построен с использованием моделей генов, предсказанных для каждого образца с помощью CD-HIT-EST (v4.6.6), в котором использовался жадный алгоритм инкрементной кластеризации; критерий идентичности составлял >95%, а перекрытие составляло >90% более коротких генов (Hyatt et al .,  2010 ).

Таксономическая классификация и функциональное назначение генов

Выравнивание DIAMOND (v0.8.20) проводили по базе данных NCBI-NR со значением E <1 × 10 ^-5 и оценкой > 60 для таксономических присвоений белковых последовательностей. Относительная численность ортологической группы (KO) типа, рода, вида, Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) и относительная численность ортологической группы eggNOG (OG) рассчитывались путем суммирования численности генов для каждой категории на образец на основе результатов. таксономических присвоений, аннотаций KO и OG соответственно. Относительная численность генов также была суммирована в функциональные профили KEGG и eggNOG для функционального анализа (Jaime et al .,  2016 ).

Различия проверялись на уровне операционных таксономических единиц (ОТЕ), рода и семейства. Признаки, прошедшие парный тест Уилкоксона, считались успешными биомаркерами. Относительную численность каждого таксона, KEGG и модуля в КЭ и контроле анализировали с помощью непараметрического U — критерия Манна-Уитни (для двух групп) или критерия Крускала-Уоллиса (для более чем двух групп). Все эксперименты проводились с параметром LEfSe α для парных тестов, установленным на 0,05 для тестов на нормальность класса и подкласса, а порог логарифмического балла анализа LDA был установлен на 2,0 (Segata et al. , 2011  ) .

Вклад авторов

Цюань-Хун Яо и Юн-Шэн Тянь разработали исследование. Эти эксперименты провели Ли-Хе Пэн, Вэнь-Хуэй Чжан, Чжэнь-Цзюнь Ли, Ли-Цзюань Ван и Юн-Донг Дэн. Цзин Сюй, Бо-Ван, Сяо-Янь Фу и Цзянь-Цзе Гао проанализировали эти данные. Хун-Джуан Хан и Ю Ван провели целевой метаболомический анализ. Ри-Хе Пэн написал рукопись.

Источник: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13972